Appunti di Microbiologia

 

 

Docente: Prof. Eugenio A. Debbia

 

ANNO ACCADEMICO 2014-2015

 

Aggiornati dicembre 2014

(vedi anche le diapositive)

 

Informazioni:

Università di Genova

Facoltà di Medicina e Chirurgia

DISC

Sezione di Microbiologia,

Largo Rosanna Benzi 10,

16132 Genova

Tel: +39-010-353 38136,

cell (2): 329 260 5218

FAX: +39-010-353 7698

e-mail: eugenio.debbia@unige.it

 


Per praticità molte immagini sono state sostituite da quelle contenute nelle presentazioni delle lezioni.

 

            

 


 

MICROBIOLOGIA GENERALE

 

Generalità

I batteri sono organismi unicellulari visibili al microscopio diffusi in ogni ambiente terrestre e distinguibili tra loro per esigenze nutrizionali e adattabilità ambientali.

Appartengono al mondo dei protisti che include alghe, funghi, protozoi e virus (Figura 1). I protisti sono divisi in due gruppi principali: i procarioti e gli eucarioti sulla base della presenza in questi ultimi di una ben evidente membrana  nucleare, che contiene il materiale genetico, del tutto assente nei procarioti.

 

Protisti

Eucarioti

Batteri                 

Nucleo evidente con membrana  

Nucleo non evidente

Alghe

Eubatteri

Protozoi

Clamidie,Spirocheti

Miceti   

Micoplasmi

 

Ricketsie

 

Una caratteristica importante dei batteri, rispetto alle cellule superiori (eucariote) è la presenza di un involucro rigido (salvo rare eccezioni: micoplasmi, clamidie ecc.,) costituito da un grosso polimero detto peptidoglicano (vedi oltre) che conferisce loro una forma, una dimensione e una protezione nei confronti dell'ambiente esterno.

Al microscopio sia ottico, sia elettronico, si presentano sotto diversi aspetti (Figura 2) che sono riconoscibili come cocchi, bastoncini o bacilli, coccobacilli, spirilli, treponemi, ecc., caratteristiche che facilitano la loro identificazione.

Le dimensioni sono piuttosto variabili da 0,4 - 2 mm  nei cocchi a 0,5 - 20 mm nei bastoncini.

 

Figura 2. Morfologia dei batteri

1. Cocchi,
2. Diplococchi,

3. Streptococchi,
4. Stafilococchi

5.Tetradi di cocchi,
6. Coccobacilli

7. Clostridi,
8. Bastoncini,

9. Carbonchi,
10. Fusobatteri

11. Vibrioni,
12. Spirilli

13. Borrelie,
14. Treponemi

15. Leptospira

 

                                              

 

 

A causa della loro trasparenza alla luce sono difficilmente individuabili mediante l'osservazione diretta al microscopio ottico, mentre con un microscopio a contrasto di fase appaiono scuri ben delineati in campo chiaro. Da tempo è noto che un semplice trattamento con un colorante (blu di metilene, fucsina, ecc.) rende i microorganismi chiaramente visibili al microscopio ottico. Agli inizi del secolo un ricercatore danese H. C. Gram, nel tentativo di mettere in evidenza i microorganismi nei tessuti infetti, ideò una colorazione che si rivelò molto utile per l'individuazione di strutture procariotiche fondamentali. I batteri si dividono in gram-positivi e gram-negativi.  Le attuali informazioni consentono di affermare che i batteri possiedono due tipi di involucro esterno o parete, attraverso il quale alcune molecole (ad es. coloranti) o antibiotici possono entrare o uscire più facilmente dalla cellula rispetto ad altre.

La colorazione di Gram si esegue esponendo una sospensione batterica essiccata e fissata  al calore o chimicamente su un vetrino, a  cristalvioletto fenicato per 1 m, quindi soluzione di Lugol (iodio iodurato) per 45", si lava con acqua e si decolora con alcool a 95° per 30", ancora con acqua per allontanare l'etanolo, quindi si tratta con fucsina per colorare tutto ciò che ha perso il colore dopo trattamento con alcool. I microorganismi gram-positivi non si decolorano e quindi trattengono il cristalvioletto, mentre i gram-negativi assumono la colorazione rossa della fucsina  perché totalmente decolorati dall'alcool.

Questa colorazione che stabilisce le caratteristiche tintoriali di un microorganismo è generale poiché non porta ad una individuazione di una certa specie, ma identifica la natura della parete batterica in generale, fatto di per sé molto importante come si avrà modo di trattare più avanti. Un esempio di colorazione più specifica e quella di Ziehl-Neelsen che risulta utile per l'identificazione dei batteri alcool-acido-resistenti, come ad esempio Mycobacterium tuberculosis.

Anatomia della cellula batterica

Schematicamente dall'esterno verso l'interno i batteri presentano:

a) biofilm (glicocalice o slime)

b) capsula

c) flagelli, pili o fimbrie

d) involucro (parete in generale) totalmente diverso tra gram-positivi e gram-negativi (tale differenza è messa in rilievo proprio dalla colorazione di Gram)

e) membrana citoplasmatica

f) mesosomi

g) citoplasma

cromosoma o altro materiale genetico accessorio: es. plasmidi.

                                                                                                                ribosomi

                                                                                                                corpi inclusi

 

Biofilm e capsula

L'involucro dei microorganismi può presentare nella parte più esterna una struttura di natura polisaccaridica non ben delineata e facilmente separabile dal corpo batterico nota come glicocalice (slime). E' generalmente sintetizzata da batteri adesi a superfici lambite da liquidi, in clinica ad esempio sui cateteri venosi o urinari e in generale su protesi o su tessuti colonizzati. Tale struttura non appare essenziale per la sopravvivenza dei microrganismi ma li aiuta formando una barriera (filtro) nei confronti di sostanze antimicrobiche o di altri organismi. Quando sui cateteri si nota la formazione di slime l'unica soluzione terapeutica è la sostituzione del catetere. Considerando la cavità orale, ci si è chiesti da tempo perché le difese dell'ospite non siano in grado di prevenire la formazione e l'estensione della placca subgengivale, la più recente risposta chiama in causa il biofilm o glicocalice che si forma durante l'adesione e la stabilizzazione della placca batterica sulla superficie dei denti o delle gengive impedendo l'attività dei composti che esplicano la loro azione sulla superficie dei batteri (surfattanti), antibiotici, immunoglobuline e l'intervento dei macrofagi. Più consolidata e più all'interno si trova la capsula, sempre di natura polisaccaridica, aderente all'involucro e molto importante come fattore di patogenicità. La capsula protegge dalla fagocitosi e dall'azione di certi antibiotici, gioca un ruolo  fondamentale nell'adesività' e nella colonizzazione di diversi substrati (denti). La capsula degli anaerobi è importante perché favorisce la formazione degli ascessi.

Flagelli

Sono appendici disposte sulla parte esterna dell'involucro. Nei batteri di forma bastoncellare possono presentarsi in tre modi: singolo flagello polare (monotrico), ciuffo di flagelli ai due poli (lofotrico) o disposti sull'intera superficie esterna (peritrico).

Il filamento è formato da subunità di una proteina detta flagellina. Il flagello è inserito sul corpo batterico sino a livello della membrana. Il corpo basale consiste in una o due copie di anelli ove può ruotare come un asse in una boccola. Il flagello possiede un moto rotatorio nei due sensi orari, l'energia è fornita dalla forza protonmotrice. Tale forza è generata dagli ioni che rientrano nella cellula (attraverso la parete e generano ATP) a causa di un gradiente ionico che si forma durante i processi energetici cellulari.  Il flagello consente alla cellula di muoversi nella varie direzioni. Il movimento è casuale con rapide inversioni di direzione, la presenza di sostanze nutrienti (attraenti) determina una riduzione del numero delle inversioni quando la cellula si muove verso il composto. Il movimento verso molecole che attraggono la cellula batterica si chiama chemiotassi positiva, la situazione inversa si ha in presenza di sostanze nocive per i batteri (repellenti) in tal caso si ha allontanamento del microorganismo (chemiotassi negativa).

Pili o Fimbrie

Le fimbrie sono appendici diverse dai flagelli, sono costituite da una proteina detta pilina che gioca un ruolo fondamentale nel processo di adesione dei batteri ad altre cellule (patogenicità). Spesso sono codificati dai plasmidi (vedi oltre) sia come fimbrie per l'adesività sia come pilo detto sessuale per creare un ponte citoplasmatico tra due cellule batteriche nei processi di coniugazione.


 

 


Involucro delle cellule batteriche

Rivestimento costituito da diversi strati che include la cellula batterica.

Esistono due differenti tipi di involucro fondamentali:

Gram-positivi consiste essenzialmente di tre strati:

a) membrana citoplasmatica (membrana interna simile a quella dei gram-negativi) 

b) spesso strato di peptidoglicano (è sottile nei gram-negativi)

c) strato superficiale non sempre presente detto capsula (simile nei gram-negativi)

Gram-negativi (più complesso)

a) membrana citoplasmatica (membrana interna simile a quella dei gram-positivi)

b) spazio periplasmatico (è spesso nei gram-positivi)

c) sottile strato di peptidoglicano (non presente nei gram-positivi)

d) membrana esterna (non presente nei gram-positivi)

e) strato superficiale non sempre presente detto capsula  (simile nei gram-positivi)

 

La parete (cell wall)

E' lo strato compreso tra la membrana citoplasmatica e la capsula.

Gram-positivi: peptidoglicano e acidi teicoici

Gram-negativi: peptidoglicano, lipoproteine, membrana  esterna e lipopolisaccaride (LPS)

Come già detto i batteri , sono classificati come gram-positivi o gram-negativi in accordo alla loro proprietà di ritenere il cristalvioletto dopo trattamento con alcool.  Se l'alcool non decolora la fucsina non agisce ed essi restano scuri.

Questa differenza risiede nella struttura della parete e per quanto molto si conosca sulla composizione chimica dei batteri il significato di questa differente risposta alla colorazione è attribuibile al maggior spessore del peptidoglicano dei gram+ che agisce con effetto spugna e nel tempo di 30" di trattamento con alcol non il cristalvioletto non riesce a defluire del tutto a differenza di ciò che avviene nei gram-. La parete fornisce ai batteri protezione osmotica (5-20 atm), e gioca ruolo fondamentale nella divisione.  Non dimostra particolare permeabilità selettiva.

Il peptidoglicano è un complesso polimero strutturato in tre parti: lo scheletro (N-acetilglucosammina e acido  N-acetil muramico), un gruppo tetrapeptide e un gruppo peptide (cross-bridge) (legame crociato)

Lo scheletro è lo stesso per varie specie batteriche, il tetrapeptide ed il legame crociato possono variare

 

Figura 5.  Differenze strutturali dell'involucro dei gram-positivi e dei gram-negativi .

 

 

 

Gram-positivi

La parete dei gram-positivi contiene quantità notevoli di ac. teicoico e ac. teicuronico (sino 50%), vi è inoltre uno strato di polisaccaride.

 

Gli acidi teicoici sono presenti in due tipi: ac. teicoico di parete e quello di membrana (ac. lipoteicoico) che è legato ai glicolipidi della membrana e concentrato nei mesosomi.

Gli ac. teicoici legano il magnesio e lo forniscono alla cellula. Si legano inoltre al calcio e giocano un ruolo fondamentale per l'adesività dei gram-positivi alla superficie dei denti (idrossiapatite che contiene calcio)

 

Gli ac. teicuronici sono polimeri simili che presentano però ac.  N-acetilmansuronico (acido-zuccheri) ecc al posto dell'acido fosforico.  Sono sintetizzati al posto dell'acido teicoico quando il fosfato e' limitato.

Polisaccaride: polimeri di mannoso, arabinoso, galattoso, ramnoso e glucosammina e altri acido zuccheri.

Gram-negativi

La parete dei gram-negativi presenta tre componenti posti all'esterno dello strato di peptidoglicano:

1) Lipoproteina

2) Membrana esterna

3) Lipopolisaccaride (LPS)

 

1) Lipoproteina

Molecole costituite da non usuali lipoproteine legate al peptidoglicano e alla membrana esterna. Sono composte da 57 aminoacidi  con ripetizioni di 15 aminoacidi in sequenza, un peptide è legato ad un residuo di acido diaminopimelico (DAP), un aminoacido che si trova solo nella parete dei batteri (può sostituire la lisina, dipende dalle specie)

2) Membrana esterna (Outer Membrane [OM])

La OM e' costituita da un doppio strato di fosfolipidi il più esterno del quali e' una componente del lipopolissaccaride (LPS).  E' uno strato a mosaico contenente un set di proteine specifiche incastrate in una matrice fosfolipidica.

La OM impedisce la perdita di proteine dello spazio periplasmico e protegge i batteri dai sali biliari e dagli enzimi idrolitici dell'ambiente. La presenza di pori consente l'ingresso di molecole a basso peso molecolare ed in parte previene l'ingresso di alcuni antibiotici.

La proteina matrice (matrix protein) è una costituente fondamentale (Omp: outer membrane protein) formata da trimeri che formano pori lungo la OM per consentire l'ingresso di molecole di soluto.  Altro gruppo lamB, tsx, responsabili dell'ingresso di alcuni zuccheri (maltoso).

Terzo gruppo comprende proteine (ompA) che sono coinvolte nell'ancoraggio della OM con il peptidoglicano e possono rappresentare dei recettori per alcuni fagi (virus batterici).

Sono presenti inoltre enzimi (fosfolipasi, proteasi) e proteine che legano la penicillina note come PBP(vedi oltre).

Tutte queste proteine sono sintetizzate da ribosomi localizzati sulla membrana interna (IM), non e' noto il meccanismo con cui sono poi trasferite al OM.  Una possibile sede e' quella della giunzione di Bayer  che pone in unione la IM con OM.

3)  Lipopolisaccaride (LPS)

LPS consiste in un complesso lipide, chiamato LIPIDE A, al quale è attaccato un polisaccaride formato da un core e da  una serie di unita' ripetute.

Il lipide A e' costituito da unita' di-saccaridiche di glucosammina fosforilata al quale sono attaccate acidi grassi a catena lunga (ac. ß-hydroxymiristic, sempre presente, altri possono variare)

Il core del lipopolisaccaride è costante in tutte le specie gram-negative, e' formato da unita' tri-, tetra- o pentasaccaridiche.

Il LPS e' carico negativamente, tutte le catene sono unite tra loro in modo non covalente da ioni bivalenti, questo fornisce alla molecola stabilita' e impermeabilità alle molecole idrofobiche.

Può essere rimosso con agenti chelanti, o con antibiotici come le polimixine, e gli aminoglicosidi.

LPS, che e' estremamente tossico per gli animali, e' stato denominato ENDOTOSSINA dei batteri gram-negativi, e' liberato nell'ambiente quando la cellula lisa.  La tossicità si deve al lipide A. LPS rappresenta il maggior antigene di superficie delle cellule noto come antigene somatico O.

Data la grande variabilità di LPS, la risposta immunitaria verso questa struttura non può essere definitiva. Tanto è vero che non esistono vaccinazioni a lungo termine nei confronti dei gram-negativi.  E' sintetizzato nella membrana citoplasmatica, ed e' necessario per il funzionamento di molte proteine della membrana esterna.

4) Lo spazio periplasmico

E' compreso tra la membrana interna e quella esterna, e' riempito da un gel formato da peptidoglicano idratato.  Diffusi nel gel vi sono inoltre proteine ed oligosaccaridi nonché proteine leganti specifici substrati, enzimi come la fosfatasi alcalina che reagendo con substrati li rendono trasportabili all'interno.  Molti di questi composti intervengono nella regolazione della pressione osmotica, per esempio, cellule che crescono in ambiente ipotonico aumentano la sintesi di oligosaccaridi.

Enzimi attivi sulla parete

Lisozima, contenuto nella saliva, lacrime e mucosa nasale,

Autolisine, contenute negli stessi batteri: glicosidasi,  amidasi, e peptidasi (enzimi che intervengono sulla sintesi di parete).

 

Figura 6. Rappresentazione schematica del lipopolisaccaride (LPS)

 

 

 

Sintesi di parete

Nei cocchi avviene per inserzioni di nuove molecole lungo il piano equatoriale, nei bastoncini prevalentemente ai poli.

La sintesi del peptidoglicano inizia nel citoplasma mediante reazioni che portano alla formazione delle due molecole base: l'acido N-acetil muramico (NAM) e N-acetilglucosamina (NAG). In breve, NAG-fosfato interagisce con fosfoenolpiruvato e poi è ridotto dal NADPH, si forma così NAM. A tale molecola viene addizionato, in varie tappe e con l'intervento di un enzima detto racemasi, D-ala sino a formare NAM-pentapeptide (NAMPP). Un trasportatore lipidico (bactoprenolo) porta il composto a livello della membrana citoplasmatica. Qui si ha la formazione del pentapeptide disaccaride NAG-NAM-PP (DSP). Un'enzima detto transglicosilasi permette l'unione del DSP alle analoghe strutture già presenti sulla parete che in pratica sono rappresentate dalle catene  -NAM- NAG-NAM-NAG- ecc. . Le transpeptidasi sono altri enzimi che consentono al pentapeptide, legato al NAM, di interagire con un altro pentapeptide di un'altra catena -NAM-NAG-NAM- ecc. Questi legami consentono alle catene principali formate da NAM e NAG di essere unite le une alle altre come una grossa rete. Un terzo enzima può intervenire per rompere i legami tra le catene del pentapeptide (carbossi- o endo-peptidasi) per inserire nuove molecole. Si ritiene che quest'ultimo catalizzatore svolga un ruolo primario nella determinazione dello spessore dello strato di peptidoglicano (Figura 6).

Membrana citoplasmatica

 

Struttura

Costituita da fosfolipidi e proteine

Non contiene steroli (presenti negli eucarioti)

Presenta diverse invaginazioni che formano strutture specializzate chiamate MESOSOMI.

Mesosomi del setto: sono coinvolti nella formazione del setto traverso durante la divisione. Al mesosoma del setto e' attaccato il DNA sia cromosomico sia  plasmidico.

Altri mesosomi sono presenti nelle varie specie batteriche che hanno un sistema di trasporto di elettroni particolarmente attivo (batteri fotosintetici e quelli che fissano l'azoto) in tal caso i mesosomi contengono una gran quantità di enzimi.


 

Figura 7. Rappresentazione schematica della sintesi di parete

 

 

Funzioni della membrana citoplasmatica

1)            permeabilità' selettiva e trasporto dei soluti

2)            trasporto di elettroni e fosforilazione ossidativa

escrezione di enzimi idrolitici

4)            contenere enzimi o proteine trasporto (carrier) che sono deputate: i) alla sintesi del DNA, ii) ai polimeri della parete, iii) ai lipidi della membrana.

5)    contenere recettori ed altre proteine necessarie alla chemiotassi

Il 50% della membrana si presenta in uno stato semifluido dovuta alla grande attività necessaria per la crescita batterica.

1) Permeabilità

Diffusione passiva

Avviene solo in risposta a differenze di concentrazioni di un soluto attraverso la    membrana   (acqua, gas, altri nutrienti)

Diffusione facilitata

Per quei composti ai quali la membrana e' altrimenti impermeabile.  Mediata da specifiche proteine dette PERMEASI o proteine di trasporto. E' simile alla diffusione passiva in quanto il processo non richiede energia.  Più rapida della diffusione passiva per la sua natura enzimatica, specifica per il substrato, a volte le permeasi sono inducibili. Entra in questo modo il glicerolo.

Trasporto attivo (primario e secondario)

Meccanismi che permettono ad un soluto di entrare nella cellula  contro un gradiente  di   concentrazione termodinamicamente sfavorevole.

Nei batteri aerobi si crea energia attraverso i processi ossidativi che provocano l'uscita dalla cellula di protoni (si stabilisce la forza protonmomotrice).  Questi rientrano attraverso una proteina di membrana detta ATPasi.  Il flusso degli ioni all'interno dell'enzima genera energia che viene utilizzata per formare ATP da ADP.

Primario

Nel periplasma dei batteri gram-negativi esistono proteine dette PROTEINE LEGANTI che hanno due ruoli nel trasporto:

 a) si legano a molte molecole di substrato aumentandone la concentrazione nel periplasma ove le permeasi lo catturano e lo portano all'interno

b)            interagiscono con le permeasi stimolandone l'attivita'

Secondario

La forza protonmotrice e' una sorgente di energia, infatti il gradiente formato consente il reingresso di protoni nella cellula (trasporto attivo secondario).  Le permeasi legano le molecole e sfruttando questo flusso mediano l'ingresso di molecole all'interno.

Sistema delle fosfotransferasi

Questo e' noto come traslocazione di gruppo.  Certi substrati appena entrati nella cellula sono modificati chimicamente in una forma impermeabile alla membrana.  All'interno sono possibili quindi concentrazioni del composto molto elevate senza mutare alle nuove molecole la possibilità di ingresso a causa della bassa concentrazione esterna. In genere questo processo coinvolge gli zuccheri.  Una proteina carrier nel citoplasma è fosforilata a spese del fosfoenolpiruvato, questa lega lo zucchero libero che e' all'esterno e lo porta nel citoplasma liberandolo come zucchero fosfato.

2)Trasporto elettroni e fosforilazione ossidativa

Nella membrana citoplasmatica sono localizzati gli enzimi della catena respiratoria, i citocromi e certe deidrogenasi.  La membrana perciò' sembra un analogo funzionale della membrana interna dei mitocondri.

 

3) Escrezione di enzimi idrolitici

I batteri hanno la possibilita' di degradare macromolecole grazie al fatto che liberano nell'ambiente enzimi (esoenzimi) che riducono la macromolecola ad unita' píu' semplici che possono entrare nella cellula.  Gli enzimi sono sintetizzati nel citoplasma come preproteine aventi una sequenza idrofobica di 20 amminoacidi.  Questa proteina raggiunge la membrana.  Una volta giunto il segnale la sequenza e' rimossa e l'enzima e' liberato nell'ambiente.

Appartengono a questo gruppo gli enzimi inducibili (zuccheri, antibiotici, ecc.)

 

4) Funzioni biosintetiche

La membrana citoplasmatica e' il sito dei lipidi ove sono assemblate le varie subunita' della parete cellulare e degli enzimi relativi a tale sintesi.  Vi sono inoltre  alcuni enzimi che intervengono nella sintesi del DNA (contenuti nei mesosomi) e di alcuni fosfolipidi.

 

5) Sistema della chemiotassi

Sostanze denominate attrattanti (zuccheri o nutrienti vari) e repellenti (antibiotici o sostanze tossiche) si legano a particolari recettori posti sulla membrana. La cellula è in grado di promuovere, grazie ai flagelli movimenti che tendono ad allontanarla dalle sostanze repellenti e, al contrario, ad avvicinarla ai composti utili.

 

Agenti antibatterici che sono attivi sulla membrana

Detergenti che contengono il gruppo lipofìlico o idrofilico sono in grado di distruggere la membrana e uccidere la cellula.

Antibiotici:  polimixine,

Ionofori: sono agenti  che  alterano la permeabilità, valinomicina, alterano il potenziale di membrana.

 

Figura 8. Rappresentazione della formazione del gradiente protonico sulla membrana esterna.

 

 

 


Figura 9. Rappresentazione schematica delle modalità di ingresso delle molecole attraverso la membrana esterna.

 

 

 

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