10 - PRODUZIONE DI ENZIMI (in collaborazione con Livio Radin)

Introduzione

La produzione industriale di enzimi ad opera di microorganismi presenta i seguenti vantaggi: lo sviluppo microbico garantisce un prodotto abbondante; i microorganismi possono essere manipolati geneticamente; la maggior parte degli enzimi microbici vengono secreti all'esterno.

Presupposti

Molte specie batteriche elaborano enzimi che hanno importanza nella produzione industriale di alimenti o altro in particolare:

Bacillus subtilis, B.licheniformis, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, A.oryzae

non rientrano tra i patogeni o non liberano prodotti tossici

Lactobacillus e Streptococcus che sono utilizzati per la preparazione di cibi e bevande.

Microorganismo adatto per la produzione dell’enzima voluto

Modifiche genetiche del microorganismo per aumentare la resa del prodotto

Terreno di coltura

Si analizzano molti ceppi selvaggi e molti mutanti derivati, ad esempio la temperatura di crescita per produrre enzimi stabili a determinate T. Non sempre predittivo.

Più microorganismi potrebbero produrre enzimi che catalizzano la stessa reazione ma in quantità variabile

Il terreno di crescita incluso il grado di acidità potrebbero influire sul prodotto (enzimi che operano a pH diversi)

Quando identificato il microorganismo va convertito in un ceppo che sia adatto per gli usi commerciali:

Ottenere grandi quantità di prodotto e ad alta concentrazione

Vi possono essere diversi problemi che si oppongono ad una resa elevata

Ad esempio la repressione del catabolità ove un composto più facilmente metabolizzato (glucoso) non stimola la produzione dell’enzima che degrada un certo substrato. Si può ovviare con la selezione di un resistente ad un analogo del substrato (glucoso=2-deoxiglucoso) usato per isolare un Tricoderma spp. che produce cellulasi o B.licheniformis per produrre a-amilasi

Altro problema può essere che l’enzima per essere prodotto ha bisogno di un induttore: molti hanno costi elevati.

La via più semplice è isolare un mutante costitutivo

Il prodotto extracellulare richiede maggior elaborazione che l’enzima intracellulare oppure si tratta di un polipeptide che diviene funzionale dopo proteolisi

Su substrato solido o in fermentatore, quest’ultimo metodo prevale

Parametri fondamentali: pH, tensione di ossigeno in entrata e in uscita così come anidride carbonica, temperatura, pressione schiuma, densità delle cellule

Il substrato è molto importante perchè incide sui costi in genere sono sottoprodotti di altre lavorazioni, tipici substrati:

melasse, orzo, cereali, grano, farina di semi di cotone, noccioline, amido, lattosio, fagioli ecc. dipende molto dal tipo di agricoltura o industria si trova in loco.

E’ prontamente idrolizzato da acidi minerali a D-glucoso(è il metodo usato da lungo tempo per preparare gli sciroppi)

Si allestisce una sospensione al 20% di amidi a pH2 a 140°C. Si possono avere ripolimerizzazioni e quindi con rese del 50% rispetto alla teorica

La miscela è neutralizzata con carbonato.

Questa tecnica porta alla formazione di sali e di altri sottoprodotti incluso il monosaccaride psicoso che non è metabolizzato

Circa un terzo dell’amido prodotto è utilizzato nell’industria della carta e tessile mentre il restante in quella alimentare. L’idrolisi dell’amido crea una vasta gamma di prodotti che variano in termini di osmolarità, viscosità e potere dolcificante:

Sono utilizzate tre classi di enzimi:

le a-amilasi, enzimi che idrolizzano il legame a-1, 4

le glucosaminidasi che idrolizzano i legami a-1, 4 e a-1, 6

le pullulonasi che idrolizzano le catene laterali a-1, 6

Il processo consiste in alcune fasi.

liquefazione: si converte l’amido a maltodestrina richede pH neutro, T= 95-107 °C per breve tempo, presenza di ioni Ca++ e a-amilasi prodotte da B.licheniformis

saccarificazione: conversione di maltodestrina a glucoso, è realizzata mediante miscela di due enzimi glucoamilasi (Aspergillu niger) che rompe il legame a- 1, 4 molto rapidamente e la pullulonasi (Bacillus spp.) che rompe velocemente il legame a-1, 6

richiede bassa temperatura per impedire la formazione di psicoso e del caramello

il glucoso ottenuto può esere fosforilato a glucoso 6 fosfato per essere poi isomerizzato a fruttoso 6 fosfato

Enzimi impiegati in vari processi industriali

Alfa-amilasi

L'alfa-amilasi scinde i legami alfa-1,4-glucosidici dell'amido con produzione di oligosaccaridi e maltosio. I microorganismi utilizzati sono il Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae e A. niger. L'alfa-amilasi trova applicazione nei seguenti procedimenti industriali.

- Panificazione. I lieviti non possono idrolizzare l'amido perchè sono privi di amilasi. L'alfa-amilasi viene aggiunta all'impasto di pane per scindere parzialmente l'amido e generare zuccheri che i lieviti convertono in anidride carbonica utile per la lievitazione.

- Produzione della birra. Per incrementare il contenuto in amido si suole aggiungere al malto grano o riso. Per favorire l'idrolisi dell'amido, durante la fermentazione si aggiunge una alfa-amilasi termostabile prodotta dal B. subtilis.

- Produzione di alcool. L'alfa-amilasi viene impiegata per ridurre la viscosità dell'amido gelatinoso che si genera per cottura del grano usato nella produzione del whisky.

Sciroppi zuccherati. L'alfa-amilasi è impiegata nell'idrolisi dell'amido per la produzione di sciroppi zuccherati ad elevato tenore di fruttosio. Intervengono diversi enzimi che convertono l'amido in oligosaccaridi e maltosio, i quali vengono trasformati in glucosio e fruttosio.

Nell’industria tessile l’amido è utilizzato durante la lavorazione dei tessuti per proteggere le fibre. L’alfa-amilasi è aggiunta per eliminare l’amido prima delle fasi finali della lavorazione (coloritura)

Proteasi

Le proteasi idrolizzano i legami peptidici delle proteine.

Le proteasi sono impiegate in numerosi processi industriali.

- Panificazione. Le proteine del glutine presenti nella farina di grano influenzano il tempo di mescolamento dell'impasto e la qualità del pane. L'aggiunta di proteasi all'impasto migliora la qualità del prodotto. Le proteasi impiegate sono prodotte dall'Aspergillus oryzae.

- Trattamento della carne. Le proteasi sono impiegate per rendere più tenera la carne. Tali enzimi sono deposti sulla superficie delle fettine di carne prima della cottura e degradano parzialmente le proteine muscolari. Preparazioni enzimatiche ammorbidenti la carne contengono 2% di papaina e 5% di proteasi fungine.

- Detersivi. Le proteasi alcaline sono aggiunte ai detersivi per favorire la rimozione dagli indumenti di macchie causate da materiali ricchi di proteine (latte, uova, sangue).

Rennina. La rennina trasforma la caseina del latte in caglio. L'impiego della rennina bovina nella preparazione industriale dei formaggi è stato sostituito dall'impiego di proteasi rennina-equivalenti prodotte dai funghi Mucor pusillus e M. miehei.

Glucosio ossidasi. La glucosio ossidasi trasforma il glucosio in acido gluconico con formazione di perossido di idrogeno. Tale enzima viene utilizzato nell'industria alimentare per rimuovere l'ossigeno dalla maionese, dalla frutta sciroppata per impedirne il deterioramento e la decolorazione. La glucosio ossidasi impiegata è prodotta da Aspergillus niger.

Invertasi. L'invertasi prodotta dai lieviti è utilizzata nell'industria dolciaria per idrolizzare il saccarosio in prodotti dotati di maggiore potere dolcificante (glucosio e fruttosio).

Produzione di enzimi

La maggior parte degli enzimi batterici e fungini di importanza industriale sono prodotti da colture sommerse all'interno di grandi fermentatori.

Enzimi immobilizzati

Grazie a tecniche di isolamento rapide e semplici, gli enzimi sono riutilizzati più volte. La tecnica più diffusa,

l'immobilizzazione degli enzimi, consiste nel fissare le molecole enzimatiche solubili a supporti insolubili ed inerti. Un altro metodo utilizza la glutaraldeide che forma legami incrociati tra le singole molecole proteiche con formazione di aggregati. Un terzo metodo consiste nell'intrappolare le molecole enzimatiche all'interno di un gel.

Gli enzimi immobilizzati possono essere impiegati con varie modalità. La più semplice prevede il mescolamento dell'enzima immobilizzato con un lotto del relativo substrato. L'enzima interagisce col substrato e lo converte nel prodotto finale. Questo metodo è efficace e poco costoso.

Col metodo dell'impacchettamento l'enzima immobilizzato, posto in una colonna, forma un letto bene impacchettato su cui si fa defluire la soluzione contenente il substrato. Il substrato reagisce con l'enzima e si converte nel prodotto desiderato. Questo metodo permette un ciclo continuo di produzione. Per evitare il rallentamento del flusso si può ricorrere al metodo del letto fluido, in cui il diametro del cilindro aumenta via via che si procede dal basso verso l'alto.

L'immobilizzazione degli enzimi offre i seguenti vantaggi: le attività enzimatiche risultano più stabili; la purificazione del prodotto finale è semplificata; il processo di formazione del prodotto della reazione enzimatica può essere reso continuo.

AMINOACIDI

Rappresentano un gruppo di composti che sono utilizzati come integratori alimentari o per dare sapore agli alimenti, nonchè per uso terapeutico

Non bisogna dimenticare che molti aminoacidi sono essenziali per molti animali superiori in quanto incapaci di sintetizzarli sono ottenuti dalle proteine del cibo o dai batteri, mentre la sorgente più importante è rappresentata dal seme di molte piante.

Lisina, metionina, triptofano, leucina, arginina, treonina sono tra i principali

La produzione industriale di aminoacidi mediante fermentazione microbica è aumentata in questi ultimi anni.

Gli aminoacidi di maggiore importanza commerciale sono l'acido glutamico e la lisina.

La maggior parte degli aminoacidi di interesse industriale era ottenuta mediante idrolisi di proteine vegetali (grano e soia). L'aminoacido più richiesto era l'acido glutamico, usato come aromatizzante. Gli elevati costi di produzione spinsero i giapponesi a ricercare metodi alternativi per ottenere tale aminoacido. Fu isolato un batterio, Corynebacterium glutamicum, capace di secernere elevate quantità di acido glutamico.

Molti batteri sintetizzano acido glutamico, ma pochi lo liberano all'esterno in quantità elevate. Era quindi necessario allestire un metodo per valutare la capacità secernente acido glutamico di numerosi ceppi batterici.

Come indicatore fu utilizzato il batterio Leuconostoc mesenteroides il cui sviluppo richiede la presenza di acido glutamico. I campioni prelevati da vari ambienti erano seminati su un terreno privo di acido glutamico in modo da ottenere lo sviluppo di colonie singole. Effettuata la replicazione, le colonie erano trattate con raggi ultravioletti e ricoperte con uno strato di agar liquido contenente cellule di L. mesenteroides. Le singole piastre venivano reincubate. Se qualcuno dei batteri presenti nel campione avesse prodotto acido glutamico, l'aminoacido sarebbe penetrato per diffusione nello strato di agar consentendo lo sviluppo di L. mesenteroides in corrispondenza di una o più colonie facilmente identificabili.

Questo metodo consentì di trovare il microorganismo adatto: C. glutamicum.

Lo sviluppo di questo batterio necessita della presenza di biotina, ma la secrezione di acido glutamico è bloccata da un eccesso di biotina. Per incrementare la sintesi di acido glutamico è necessario utilizzare substrati di crescita contenenti glucosio. La produzione di acido glutamico mediante fermentazione batterica risulta più economica di quella basata sull'idrolisi di proteine vegetali.

La produzione industriale di acido glutamico viene effettuata in colture sommerse all'interno di grandi fermentatori. Durante la fermentazione, il 70% del glucosio viene convertito in acido glutamico se le concentrazioni di biotina e di ossigeno sono appropriate e se le condizioni di pH e di temperatura sono ottimali. Se il pH diminuisce eccessivamente o se la temperatura non è quella ottimale (30-35°C), la produzione di acido glutamico si arresta.

La lisina è un aminoacido essenziale che viene impiegato come additivo alimentare; il potere nutriente del pane e dei cereali è rinforzato mediante aggiunta di lisina all'impasto di farina. Le richieste commerciali di questo aminoacido sono dunque elevate.

Il microorganismo impiegato per la produzione della lisina è un mutante del ceppo di C. glutamicum. In tale batterio, la lisina rappresenta uno dei prodotti terminali del ciclo dell'aspartato. La sua sintesi è regolata dalla concentrazione di treonina e della stessa lisina; se questi due aminoacidi sono presenti in eccesso il ciclo metabolico si arresta, se uno solo dei due è assente il ciclo procede indipendentemente dalla concentrazione dell'altro aminoacido. Questa proprietà ha favorito l'isolamento di un ceppo di C. glutamicum capace di secernere lisina. Mantenendo bassa la concentrazione di treonina, è stato isolato un mutante di C. glutamicum capace di convertire l'aspartato semialdeide in omoserina poiché privo dell'enzima omoserina deidrogenasi. Tale mutante è capace di sintetizzare la lisina ma non la metionina, treonina e isoleucina; questi tre aminoacidi devono essere aggiunti al

terreno di coltura affinché il batterio possa svilupparsi. Se il terreno di coltura è privo di omoserina e contiene una limitata quantità di treonina, il mutante secerne elevate quantità di lisina. L'enzima aspartochinasi non risente più gli effetti inibenti del meccanismo di controllo a "feedback" e converte l'aspartato in aspartato semialdeide che si trasforma tutto in lisina.

Il mutante di C. glutamicum è biotina-dipendente. Il substrato di crescita più comunemente impiegato è la molassa di canna di ligula nera.

ACIDI ORGANICI

Si sono sviluppate tecniche di fermentazione microbica per ottenere svariati acidi organici.

L'acido citrico è un potente agente chelante i cationi, viene impiegato dall'industria alimentare come acidulante nella preparazione di marmellate, gelatine e vini, e dall'industria farmaceutica come prodotto effervescente nella preparazione di compresse.

L'acido citrico veniva estratto dai limoni fino a quando fu scoperto un processo di fermentazione microbica a costi inferiori. L'agente fermentante, Aspergillus niger, è un fungo filamentoso aerobio. Trasforma le sostanze nutritive in acido citrico che secerne all'esterno.

L'acido citrico può anche essere ottenuto da colture sommerse poste in grandi fermentatori contenenti molasse o amidi idrolizzati di cereali come fonte di carboidrati. Il pH deve essere mantenuto intorno a 3,5. La fermentazione dura 4-15 giorni.

Acido gluconico

L'acido gluconico è un agente chelante e viene incorporato nei detergenti. Viene utilizzato per la preparazione di detersivi poiché previene il deposito di sostante minerali su oggetti di vetro e metalli.

Nell'industria alimentare l'acido gluconico viene usato come acidulante nella preparazione della farina, del pane, dei formaggi, delle salsicce. Nell'industria farmaceutica il gluconato di calcio viene utilizzato per trattare gli stati di carenza di calcio; gluconati sono utilizzati per aumentare la stabilità di alcuni antibiotici (tetracicline) e ridurne la tossicità.

L'acido gluconico è prodotto da un ceppo di Aspergillus niger che si fa sviluppare in colture sommerse sotto una elevata pressione atmosferica. Questo fungo possiede l'enzima glucosio ossidasi che converte il glucosio in acido gluconico. Una cospicua quantità di aria viene pompata nel terreno così da facilitare la diffusione dell'ossigeno. Il glucosio viene aggiunto alla coltura in forma cristallina o come sciroppo.

Acido lattico

L'acido lattico è prodotto per fermentazione microbica. Viene impiegato nell'industria alimentare come acidulante e aromatizzante, nell'industria farmaceutica e nella manifattura di prodotti plastici.

L'acido lattico è prodotto dal Lactobacillus delbruckii che converte il glucosio in acido lattico. Poiché si tratta di una vera fermentazione microbica, l'ossigeno non è richiesto. Poiché la temperatura ottimale per la fermentazione (49°C), inibisce lo sviluppo degli altri microorganismi, non sono necessarie condizioni di rigorosa sterilità. Substrati fermentabili sono le molasse o il glucosio.

Etanolo

La produzione di etanolo per fermentazione microbica dell'amido di grano ha richiamato l'attenzione di molti Paesi importatori di petrolio. L'etanolo mescolato con la benzina nel rapporto di 1:9 può essere usato come carburante per i veicoli a motore. La miscela etanolo- benzina potrebbe essere ottenuta con costi competitivi rispetto a quelli degli attuali carburanti.

L'etanolo viene prodotto per fermentazione del glucosio contenuto nell'amido di grano ad opera del lievito Saccharomyces cerevisiae. Il processo di fermentazione che converte il glucosio in etanolo e CO2 si arresta quando la concentrazione di etanolo raggiunge il 15%. La distillazione conclusiva richiede un dispendio energetico e fa aumentare i costi.

11 - Produzione microbica di aromi naturali (in collaborazione con Marzia Dolcino)

Per migliaia di anni gli uomini hanno usato inconsapevolmente i microorganismi per produrre cibi e bevande più saporiti. Il loro utilizzo per la produzione di birra e vini viene fatto risalire a tempi molto antichi (es. Produzione di vino in Egitto e Siria almeno 3500 anni a.C. e della birra in Babilonia dal 2800 a.C.). A dispetto del suo antico uso, il ruolo dei microorganismi come produttori naturali di aromi non è stato riconosciuto e scientificamente conosciuto fino alla prima parte di questo secolo. Per esempio uno dei primi lavori riguardo a questo argomento è stato scritto dal microbiologo V.L. Omeliansky circa 75 anni fà. Benchè appoggiati da validi strumenti sofisticati, molti moderni microbiologi usano ancora il loro olfatto quale strumento analitico di vari microorganismi sui quali lavorano (es. l'odore di terra e muffa degli attinomiceti, attribuibile alla geosmina; (l'aroma spesso fruttato rilasciato durante la fermentazione dei lieviti a partire da alcooli ed esteri) gli odori degli indoli rilasciati da molte specie di enterobatteri.

L'interesse microbiologico dell'industria degli aromi si intensifica:

Nel corso dei passati 10-15 anni si sono intensificati gli studi sulla produzione di aromi e odori prodotti da microorganismi guidati non tanto dalle necessità di riconoscere la materia in esame ma anche da un'industria di aromi in espansione nel tentativo di venire incontro alle richieste della sua diversificata clientela.

Molti ingredienti aromatizzati di cibi naturali sono prodotti per mezzo di processi tradizionali che dipendono dai materiali della pianta in origine come gli olii essenziali, i succhi di frutta o di vegetali ed i concentrati o gli estratti di piante.

La varietà di tali aromi naturali è in ogni caso limitata. Tuttavia i nuovi sistemi molecolari sviluppati dall'industria biotecnologica rendono possibile supplementare e incrementare questi ingredienti base convertendo materiali di partenza relativamente economici in aromi additivi ad alto valore aromatico utilizzabili per cibi, bevande, cosmetici ed altri generi di consumo.

I microorganismi o gli enzimi microbiologicamente derivati possono trasformare precursori naturali in valide molecole a singolo aroma note come "flavor building bloks".

Negli U.S.A. e in molti paesi europei gli ingredienti naturali microbiologicamente modificati sono comunque considerati naturali. Così il termine di aromi naturali negli Stati Uniti significa olii essenziali, oleoresine, essenze o estratti, proteine idrolizzate, distillati o altro prodotto di combustione, riscaldamento o enzimolisi che considera i componenti aromatizzanti derivati da spezie, succhi di frutta, vegetali o succhi di vegetali, lieviti commestibili, erbe, germogli, cortecce, tuberi, radici, foglie o simili materiali uova, latticini e prodotti di fermentazione la cui funzione nel cibo è quella di impartire sapore piuttosto che nutrimento.

Similmente nella Comunità europea viene data la seguente definizione "sostanze aromatizzanti o preparazioni che sono ottenute con appropriati procedimenti fisici o processi enzimatici o microbiologici da materiale di origine animale o vegetale".

Entrambe queste regolamentazioni esplicitamente includono come naturali quei prodotti che sono ricavati attraverso processi enzimatici e microbiologici, richiedendo solo che i materiali precursori siano naturali e che sia i precursori che i prodotti modificati siano reperiti in natura o siano parte dei cibi tradizionali.

Come i microorganismi producono aromi da acidi grassi:

La maggior parte dei processi microbiologici ed enzimatici di bioconversione agiscono sugli acidi grassi. Questi, derivanti dagli olii vegetali o da grassi animali sono di solito economici e relativamente utilizzabili su larga scala e sono il materiale di partenza per molti aromi e fragranze. Tali materiali spesso sono estratti sottoforma di olii trigliceridi, le lipasi commercialmente reperibili rilasciano acidi grassi da tali olii. Procedimenti industriali prestabiliti sono utilizzati per produrre molti aromi derivati dagli acidi grassi inclusi i composti che definiscono le così dette "note verdi" aromi fungini e specifici lattoni e metichetoni. In generale quando i microorgansimi degradano gli acidi grassi, il primo passo comporta la detossificazione mediante esterificazione con il coenzima A allorchè gli acidi grassi entrano nelle cellule. Una volta all'interno della cellula, il complesso acidograsso-CoA è sottoposto ad un iter di ossidazioni in cui predomina il ciclo della ß-ossidazione. Le diossigenasi microbiche (lipo-ossigenasi) le monossigenasi (enzimi citocromo P450 idrossilativi) o le idratasi agiscono sui doppi legami degradando parzialmente gli acidi grassi e possono essere importanti per la produzione di aromi.

Le lipossigenasi e le diossigenasi agiscono sulle unità cis-cis pentadieniche degli acidi grassi poli insaturi per formare derivati idroparossidi.

Anche se questi enzimi siano ubiquitari in natura, solo pochi sono stati trovati nei microorganismi. Nei mammiferi, per esempio, le lipoossigenasi sono coinvolte nelle formazione delle prostaglandine e leucotrieni che derivano dagli acidi grassi polienoici. Nei tessuti di piante frammentate le lipossigenasi degradano gli acidi grassi insaturi quali l'acido linoleico o linolenico, formando idroperossidi che sono successivamente tagliati da idroperossidi-liasi per formare composti volatili alifatici a 6 e 9 atomi di carbonio, tutti importanti aromi e sapori. (Figura 1)

I membri più importanti di questa famiglia sono il cis-3-hexenolo ed il 2-trans exenale, che sono responsabili del profumo dell'erba tagliata e dell'aroma di molta frutta e vegetali. Gli enzimi usati in questa via metabolica tuttavia non sono stati rinvenuti in batteri o funghi. Un altro acido grasso metabolita delle piante, l'acido gelsominico, un regolatore di crescita endogeno con una varietà di funzioni fisiologiche è prodotto mediante un'analoga via matabolica. Dopo una lipossigenasi produce un idroperossido derivato dall'acido linolenico, questo composto è convertito nel suo allene ossido che ciclicizza (si circolarizza). La ß-ossidazione e la riduzione dei doppi legami porta all'acido gelsominico.

Il suo metil-estere è non solo un ormone vegetale volatile, possibilmente coinvolto nelle comunicazioni tra piante, ma è anche un aroma importante che impartisce note dolci-floreali (gelsomino simile). (Fig.2)

Otto Miersch ed i suoi collaboratori dell'Istituto di Biochimica Vegetale, Halle-Sale in Germania che stavano studiando i patogeni fungini delle piante, incluso il Botrydiploidia theobromae, hanno scoperto che tali microorganismi producono l'acido gelsominico. Le tappe biosintetiche che conducono all'acido gelsominico in questi funghi filamentosi sono probabilmente simili a quelle rinvenute nelle piante.

Recentemente si sta valutando questa capacità di sintesi e si è scoperto che B.theobromae fornisce solo basse quantità di a. gelsominico in coltura liquida.

Tali osservazioni suggeriscono che la biosintesi e la secrezione dell'acido gelsominico è strettamente controllata nel corso del ciclo di crescita di questo fungo sulle piante nel suo habitat naturale.

Un altro enzima lipossigenasi-dipendente in certi funghi forma un 1-ottene-3-ol e alcoli ed aldeidi ad 8 atomi di carbonio. Questo gruppo di molecole è responsabile del tipico aroma del fungo Agaricus bisporus. Questa lipossigenasi fungina che ossida l'acido liroleico per formare l'acido 10-idroperossi-liroleico ha una specificità unica. Questa importante molecola aromatizzante viene correntemente prodotta su scala industriale da gambi di funghi altrimenti scartati per aggiunta di a. liroleico come precursore ai fungi.

I lattoni modificati:

I lattoni derivati dagli idrossi-acidi grassi appartengono alla più importante classe di aromi componenti di molta frutta, prodotti latticini e cibi fermentanti. La proprietà olfattiva di tali lattoni dipende dalla lunghezza della catena, grado di saturazione, dimensioni dell'anello lattone e chiralità. La descrizione organolettica varia dal fruttato al fiorito.

Sono ampiamente utilizzati dall'industria alimentare. Per es. il g-deca-lattone, che è il prodotto per fermentazione su scala industriale ed è uno dei pochi aromi naturali chimici, è usato in una vasta gamma di prodotti dando sia aroma di frutta che di latticino.

Molte specie microbiche, specialmente alcuni ceppi di lievito quali lo Sporodiobolus salmonicolor (Sporobolomyces odorus) producono g o d lattoni.

Sono formati per ß-ossidazione di idrossiacidi saturi ed insaturi seguite dalla chiusura ad anello ("lattonizzazione") lipasi-catalizzata in condizioni acide. Il maggior problema per la produzione industriale dei lattoni è il limite naturale di abbondanza di idrossi acidi.

L'unico precursore correntemente valido in quantità sufficiente ed ad un costo ragionevole è l'acido ricinoleico (12-idrossi C18:1), il componente principale dell'olio di ricino.

Un processo di biotrasformazione che si basa sull'olio di ricino e che fornisce un'elevata quantità di g-decolattone è stata descritta nel 1985 in seguito a ricerche della Compagnia Fritzsche, Dodge e Olcott (ora parte della Giraudan Roure). Questo processo coinvolge l'uso del fungo Yarrowia lipolytica per idrolizzare ed ossidare un estere dell'acido ricinoleico. Similmente, d-lattoni possono essere generati a partire dall'acido 1-1 idrossi palmitico nelle patate dolci (conosciute come resina jalap). Solo quantità limitate di questo idrossiacido si ritrovano nelle patate dolci, rendendone troppo costoso l'isolamento o la produzione su larga scala.

In alternativa le specie Mucor e Mortierella potrebbero venir usate per idrossilare gli acidi grassi a media catena o i loro relativi metil o etil-esteri per formare iprontamente lattonizzati acido g idrossi ottanocico e decanoico. Molto poco è noto sull'idrossilazione degli acidi grassi a media catena. Tali idrossilasi potrebbero essere correlate allo citocromo P-450 w-idrossilasi ritrovata in batteri e funghi quali il Bacillus megaterium, Candida bombicola e Fusarium oxysporum.

Simili attività di idrossilazione di fine catena sono pure rinvenute nella specie Mucor. (Fig.3)

Metil chetoni aromatizzanti derivanti da acidi grassi:

I metil chetoni (2-alcaroni) che derivano pure da acidi grassi a media catena conferiscono forti aromi associati ai formaggi e sono la base per lo sviluppo di aromi nei formaggi quali Roquefort, Camembert e Stilton. Questi metil chetoni sono formati quando le muffe usate per far maturare questi formaggi degradano gli acidi grassi a media catena usando enzimi della ß-ossidazione per generare metil chetoni che sono di un carbonio più corti dei loro precursori acidi grassi (Fig.4). I principali metil chetoni includono il 2-pentanone il 2-eptanone, il 2-nonanone ed il 2-undecanone, originati da acidi grassi con catene lunghe da 6 a 12 atomi di C.

La maggior parte dà parametri che regolano queste vie metaboliche nelle muffe usate per la maturazione di questi formaggi sono ampiamente documentati in pubblicazioni che descrivono la produzione di metil chetoni.

Tuttavia come il processo sia regolato a livello cellulare non è ancora noto. E’ fortemente favorito nelle condizioni in cui la crescita delle muffe è forzata (per es. durante la sporulazione). Probabilmente la sintesi è indotta quando i livelli cellulari di coenzima A sono limitati, riducendo così l’attività della 3-chetoscil-CoA tiolasi. Curiosamente i funghi non producono metil chetoni da acidi grassi a lunga catena anche se la loro crescita viene ristretta. Invece per competizione procede un ciclo di ß-ossidazione. Presumibilmente tali cellule microbiche contengono più di un sistema per trattare acidi grassi con catene di diverse lunghezze.

I metil chetoni sono prodotti su larga scala per mezzo di differenti processi di biotrasformazione. Uno dei più semplici coinvolge l’applicazione di spore di Penicillum roqueforti su acidi grassi a media catena o acidi grassi del latte trattati da lipasi. Altre tecnologie più sofisticate coinvolgono sistemi di fermentazione allo stato solido o a due fasi. Per es. il 2-eptanone è prodotto dall’acido ottanoico usando un fungo filamentoso immobilizzato dal genere degli Amastigomycota.

Realizzazione industriale di bioprocessazioni aromatiche:

Lo sviluppo di nuovi processi industriali microbiologici per la produzione di aromi rappresenta una considerevole sfida.

Le quantità raggiunte di questi composti sono spesso modeste, superando raramente i 100 mg/litro e non raggiungono mai un livello economicamente competitivo. Così la prima sfida da affrontare per lo sviluppo di questo interessante sistema microbiologico di produzione degli aromi è di migliorare drammaticamente la produzione sia con mezzi tradizionali quali la ricerca da i ceppi migliori, sia con le tecniche di ingegneria genetica.

Poiché molti composti aromatici ( e spesso i loro precursori ) tendono ad essere inibitori o spesso tossici per i microorganismi questa sfida è molto più grande di quanto appaia. Per esempio un tipico acido grasso precursore specialmente nella forma indissociate che è prevalente al di sotto di un pH da 4.5 a 5 è molto tossico e l'up’ake cellulare è limitato.

Questa limitazione è attuata in modo organismo-specifico. Nei batteri, per esempio, specifiche proteine di uptake restringono il trasporto transmembrana degli acidi grassi.

Tuttavia nelle cellule di lievito gli acidi grassi aggiunti al terreno di coltura diffondono liberamente attraverso le membrane cellulari. L’efficienza di questo sistema di captazione permettono alle specie quali Yarrowia, Rhodotorula e Sporodidodus di utilizzare un’ampia varietà di acidi grassi o derivati come unica fonte di carbonio. Nei funghi filamentosi i sistemi di captazione non sono ancora ben noti. Spesso poi i precursori manifestano seria tossicità per es. quando a molti microorganismi vengono somministrati acidi grassi esteri che sono idrofobici a valori di pH non acido. Questo problema è stato descritto quale fattore limitante per la produzione del g-decalattore dell’acido grasso corrispondente etil, metil estere in un brevetto concesso alla compagnia tedesca BASF. Tuttavia utilizzando il fungo filamentoso Mucor circinelloides e adattando attentamente le condizioni di crescita, abbiamo ottenuto la conversione di acidi grassi ad un tasso superiore a 0.8 gr/l per ora. (Fig.5)

In realtà, se questo microorganismo è esposto per diverse ore agli esteri tossici degli acidi grassi come l’etil-decanoato, precursore per l’acido g-idrossidecanoico ed il composto aromatico g-decalattone, la morfologia cambia e la cellula probabilmente lisa.

Separazione e Purificazione incidono sulla validità della produzione:

In altri casi per superare la tossicità degli acidi grassi precursori devono essere prese delle misure più complesse. Se la biocatalizzazione non tollera concentrazioni di prodotto economicamente ragionevole nel brodo di fermentazione, una contromisura è quella di rimuovere il prodotto appena si forma. L’uso del sistema di fermentazione a due fasi liquide, delle quali una delle due è rappresentata da una fase organica che estrae continuamente i prodotti idrofobici, costituisce un attraente metodo di vasta applicabilità per questo scopo. Tuttavia l’utilizzo di grandi volumi di solventi organici rende necessarie misure sanitarie ed anti esplosive. In alternativa una valida tecnica di separazione per membrana per l’estrazione dei prodotti potenzialmente tossici potrebbe essere compatibile con certe condizioni a fase acquosa singola. Per es. Karl W. Böddeker ed i suoi collaboratori al centro di ricerca GKSS di Geesthcht in Germania, abbina ad un sistema di preevaporazione a membrana ad un bioreattore per ottenere il lattone 6-pentil-a-pirone(6-pp) dal Trichoderme. (Fig.6)

La continua rimozione di questi componenti aromatici della noce di cocco, che inibiscono la loro stessa sintesi, incrementa marcatamente la produzione. Solo il prodotto desiderato passa attraverso la membrana altamente selettiva. Tuttavia la produttività è ancora troppo bassa per giustificare l’investimento che sarebbe richiesto per stabilire questo processo su scala industriale.

Un altro fattore complicante è quello di dover ridurre i costi di materiale.

Reazioni secondarie aspecifiche influenzano la produttività ed i costi, particolarmente se consistono in prodotti difficilmente separabili.

Anche tracce di impurezza inferiori all’1%, possono influenzare negativamente il gusto e il profumo del prodotto, riducendone effettivamente il prezzo. Qualche volta i produttori hanno dovuto inventare dei sistemi per trattare questi problematici composti. Per esempio, per migliorare l’efficienza del processo biologico di produzione del g-decalattone, la compagnia Haarman & Rainer GmbH in Germania hanno brevettato un processo per reperire il prodotto secondario 3-idrossi-g-decalattone che si forma dall’acido ricinoleico durante la fermentazione ed è coestratto con il g-decalattone.

Durante successiva distillazione il prodotto secondario è convertito nel 3, 4 insaturo g-decalattone. Nel processo brevettato questo derivato deidratato è stereoselettivamente ridotto dal Saccharomyces cerevisige come parte di una seconda biotrasformazione, aumentando la produzione del g-decalattone voluto.

Il processo dipende da una miglior comprensione del metabolismo microbico:

Per rendere migliori e più ampiamente utilizzati i sistemi microbiologici di produzione degli aromi naturali, occorre raggiungere una maggiore comprensione di come i microorganismi sintetizzano i composti aromatizzanti e sottolineare le vie metaboliche che rendono possibili queste reazioni.

Fare questo comporta identificare nuove attività enzimatiche e caratterizzarne le intere vie metaboliche, ciò include la comprensione di come sono regolate e di come la produzione dei mataboliti possa essere incrementata.

Un altro problema è quello di identificare i composti con caratteristiche cromatiche. Abbiamo analizzato isolamenti cresciuti su una varietà di acidi grassi potenzialmente precursori per la loro capacità di generare odori caratteristici. Tali composti organolettici hanno odori molto tenui e sono facilmente riconosciuti dall’olfatto umano.

Tuttavia per stabilire una procedura di screening automatizzata abbiamo adattato i sistemi di analisi sensitivi (es. gas cromatografici abbinata con spettrofotometria di massa) per analizzare continuamente sostanze volatili. Abbiamo isolato microorganismi che promettono la produzione di lattoni o di metil chetoni dagli acidi grassi ed esteri.

Un altro approccio è quello di ingenierizzare geneticamente i microorganismi con i geni codificati per gli enzimi usati dalle piante per degradare gli acidi grassi rendendo i migroorganismi ricombinanti in grado di produrre inusuali molecole aromatiche per fermentazione. Per esempio, abbiamo isolato l’acido grasso idroperossido liasi dalle piante di banana e successivamente donato il gene corrispondente che può essere espreso in Saccharomyces cererisiae.

Nelle cellule di lievito ingenierizzate la liasi derivata dalle piante toglie l’idroperossido di un acido grasso fornito nel mezzo di coltura e gli enzimi del lievito incluso l’alcool deidrogenasi, converte il prodotto modificato dalla ligasi nel composto aromatico dalle “note verdi” cis-3-exerolo.

Un successivo passo comporta l’aggiunta di un gene della pianta codificante la lipoossigenasi che permette la produzione di composti con note verdi per degradazione diretta dell’acido linoleico.

Identificando e donando i geni di altri enzimi cruciali saremmo aiutati nell’elucidere le basi biochimiche della formazione delle molecole aromatiche. La sequenza aminoacidica delle idroperossido liasi per esempio assomiglia a quelle dell’allene ossido sintasi coinvolta nella via matabolica che porta all’acido gelsominico. In accordo con Kenji Matsui del Dipartimento di chimica biologica dell’Università di Yamaguchi in Giappone, la idroperossido liasi della campanula del pepe che è specializzata per il metabolismo di lipidi idroperossidi è apparentemente un nuovo membro della famiglia del citocromo P-450. Strette interazioni tra ricerche accademiche ed industriali potrebbero aiutare per continuare questi studi.